استخراج و خالص سازی رنگدانه فیکوسیانین از جلبک اسپرولینا
رنگدانه فیکوسیانین از جلبکهای سبزآبی به ویژه اسپیرولینا بدست آمده و میزان این ماده در حدود ۷ تا ۱۴درصد وزن خشک این ریزجلبک میباشد و در سطح وسیعی در کشورهای مختلف به عنوان رنگ آبی طبیعی مورد استفاده قرار میگیرد. حدود ۵۰ درصد از کل پروتئین تولید شده توسط این سویه مربوط به خانواده پروتئینی فیکوبیلیپروتئین میباشد. فیکوبیلیپروتئینها از دسته پروتئینهای فلوروسنت رنگی محلول در آب با ساختار پیچیده بوده که از سیانوباکتریها و جلبکهای یوکاریوت بدست میآیند.
پروتئینهای رنگی فیکوبیلیزوم در سه گروه کلی فیکواریترین، فیکوسیانین و آلوفیکوسانین قرار میگیرند که هرکدام رنگ متفاوتی دارند. فیکوبیلیزومها مجموعه ای از آنتن های جذب نور در غشاهای پالستی بوده که همگی متشکل از چند زنجیره پروتئینی به نام آپوپروتئین که به صورت کووالان از محل سیستئین به فیکوبیلین متصل شده اند. فیکوبیلین یک زنجیره باز کروموفور تتراپیرول میباشد. حدود ۲۰ درصد از خانواده فیکوبیلی پروتئینها نیز مربوط به پروتئین ارزشمند فیکوسیانین میباشد. فیکوسیانین (PC-C) یک رنگدانه آبی و آنتن جمع کننده نور در سیانوباکتریها و یکی از پیگمانهای اصلی سیانوباکتریها میباشد. PC-C از دو جزء پروتئین و کروموفور تشکیل شده که بخش پروتئینی آن شامل دو زیر واحد α و β بوده که دارای وزن مولکولی بین ۱۸ تا ۲۰ کیلودالتون میباشند.
این رنگدانه محلول در آب به دلیل فعالیت آنتیاکسیدان، ضد حساسیت و محافظتکننده کبد و خصوصیت جذب امواج فیکوسیانین به طور گسترده در غذا، لوازم آرایشی و بهداشتی و دارویی استفاده میشود. همچنین از فیکوسیانین به عنوان معرف فلوروسنت برای کاربردهای تشخیصی به دلیل غیرسمی بودن و خاصیت فلوروسنت استفاده میشود. برای استفاده از رنگهای طبیعی در صنایع غذایی نیاز به دانش بیشتری در مورد پایداری شرایط رنگ و جلوگیری از تخریب آن در طول فرآیند تولید صنعتی، بستهبندی و نگهداری محصول رنگی میباشد. نتایج این مطالعات نشان میدهد شدت نور ۱۰۵×۳ لوکس به مدت ۲۴ ساعت در محلول آبی با ۵ و ۷ = pH و موجب تجزیه شدن ۸۰ درصد فیکوسیانین میشود.
براساس درصد خلوص این رنگدانه، فرآوردهها یا بیومس این جلبک کاربردهای متعددی به عنوان مکمل غذایی و دارویی پیدا می‌کند. بهبود تولید، استخراج و خالصسازی فیکوسیانین میتواند دامنه کاربرد آن را افزایش دهد.
دستورالعمل استخراج و خالصسازی رنگدانه فیکوسیانین موجود در ریزجلبک اسپیرولینا
۳-۱ -خصوصیات محیط کشت اسپیرولینا
مهمترین اصل درتوسعه فرآیند تولیدتجاری ریزجلبکها درمقیاس وسیع،افزایش تولید بیومس و ماده خام است. رشد ریزجلبکها تحت تأثیر فاکتورهای فیزیکی (نور، دماوpH)وشیمیایی(عناصرماکرو ومیکرو به عنوان موادمغذی) مختلفی قرار دارد.دراین دانش فنی ازمحیط غذایی متداول برای اسپیرولینا استفاده شد و بدیهی است بهینه سازی محیط وشرایط محیط کشت برروی نرخ رشد سویه های مورداستفاده و تولیدفیکوسیانین تاثیردارد.بهترین محیط کشت برای رشدجلبک اسپیرولینا محیطکشتزار و،دمای۲۸ درجه سانتیگراد، نور ۴۰۰-۲۰۰ و ۹ =pH
با هوادهی کافی پیشنهاد می شود. که با اصلاحات لازم برای هر سویه مناسب می باشد.
به منظور استخراج فیکوسیانین از جلبک اسپیرولینا میبایست ابتدا دیواره سلولی میکروارگانیسم شکسته شود. استخراج رنگ از جلبکهای سبزآبی به دلیل دیواره سلولی مقاوم و اندازه کوچک سلول تا حدودی دشوار است. جهت شکستن دیواره سلولی و آزادسازی فیکوسیانین از سلول، روشهای گوناگونی وجود دارد. در مقیاس تجاری و بزرگ نیاز به روشهای ساده، کارامد، موثر و مقرون به صرفه در جداسازی فیکوسیانین میباشد. مراحل فرآیند استخراج فیکوسیانین )در شکل زیر توضیح داده شده است.
مرحله تخریب سلولی و جداسازی
برای شکستن دیواره سلولی روشهای متنوعی نظیر استفاده ازفرآیندهای فیزیکی مانند شوک اسمزی، انجماد در ۲۰ -درجه سانتیگراد و بازگشت به دمای۴ درجه سانتیگراددر چند مرحله، سونیکاسیون یا استفاده ازدستگاه پرس و یا روشهای شیمیایی مانند استفاده از آنزیمها، شوینده ها (Detergents ،)اسیدها و بافرها وجود دارند. طبق مشاهدات در بین روشهای مزبور، استفاده از بافر در استخراج به دلیل حفظ ماهیت پروتئینی فیکوسیانین و تخریب کمتر آن تحت این شرایط، نتایج بهتری بدست داد. در روش استخراج با بافر، ابتدا به منظور تعیین نوع بافر آزمایشی طراحی شد که در آن بافر پتاسیم فسفات در مقایسه با بافرهای سدیم سیترات و سدیم فسفات نتایج بهتری از نظر خلوص و میزان فیکوسیانین نشان داد. لذا این بافر به عنوان بهترین محلول استخراج کننده انتخاب گردید. غلظتهای متفاوت بافر (آب، بافر ۵۰ میلیموالر و بافر ۱۰۰ میلی مولار پتاسیم فسفات( با نسبت مشخصی از بیومس اختلاط گردید و فرآیند استخراج طبق نتایج بدست آمده از آزمایشات به عمل آمده درمدت زمانهای مختلف، به مدت۴ ساعت درهمزن با دور m 220 انجام گردید. سپس نمونه ها در دور g 18000 به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفوژ شده و پس از این مرحله، قسمت رویی (فیکوسیانین ناخالص) جدا می شود.
مرحله جداسازی و خالصسازی اول
مرحله خالص سازی یکی از مهمترین مراحل تولید فیکوسیانین به شمار میرود. ۵۰ تا ۹۰ درصد هزینه های مربوط به تولید این رنگ مربوط به مراحل خالص سازی آن میباشد. بهبود تولید، استخراج و خالصسازی فیکوسیانین میتواند دامنه کاربرد آن را افزایش دهد.
براساس درصد خلوص، این رنگدانه کاربردهای متعددی به عنوان رنگ خوراکی، مکمل غذایی و دارویی پیدا می‌کند. خالصسازی این ماده پس از تولید عصاره خام، به منظور استفاده در صنایع غذایی ضروری به نظر میرسد. برای خالصسازی فیکوسیانین از موادی چون آمونیوم سولفات، کیتوزان، زغال فعال و پلیاتیلنگالیکول استفاده میشود.
پلیاتیلنگالیکول و آمونیوم سولفات هر دو جزو مواد سمی بوده که سبب می شود زمان فرآیند دراین روش بسیار زیادبوده و باتوجه به اینکه این مواد با فیکوسیانین ترکیب میشوند،جداسازی آنها ازهم بسیار دشوارمیباشد. همچنین نتایج آزمایشات انجام شده نشان داد که استفاده از آمونیوم سولفات به مدت طولانی یک یا دو روز نیاز دارد که این فرآیند موجب دناتوره شدن پروتئین فیکوسیانین و کاهش میزان فعالیت آن میگردد. کیتوزان پلیمر ترکیبی گلوکز آمین و N -استیل گلوکز آمین است که به وسیله پیوندهای۱و ۴ گلیکوزیدی به هم متصل شده اند. کیتوزان بدلیل غیرسمی بودن، خاصیت جذب بالا، خواص ضدباکتریایی وضدتوموری، امکان تجزیه در طبیعت، سازگاری با محیط زیست طبیعی، قیمت نسبتا پایین، توانایی حذف محدوده وسیعی از رنگها و فلزات، سینتیک سریع و در نهایت امکان تهیه مشتقات فراوان ازآن بسیارموردتوجه بوده و امروزه در صنایع مختلف از جمله زیست فناوری، دارویی و پزشکی، بهسازی فاضلاب، آرایشی و صنایع غذایی استفاده میشود.
واقعیت این است که توضیحات استخراج فیکوسیانین از جلبک اسپرولینا می تواند کمی پیچیده باشد اما توضیح عملی آن به نسبت آسانتر است بدین منظور علاقمندان می توانند برای کسب اطلاعات بیشتر با رویای جلبک پارس تماس بگیرند و در صورت تمایل از نزدیک با فرآیند تولید آشنا شوند.
